Fundamento básico del medio de cultivo linfocitario

SIEMBRA

• Medio de cultivo RPMI 1640

· El medio Roswell Park Memorial Institute, comúnmente conocida como RPMI, es una forma de instrumento utilizado en el cultivo de células y cultivo de tejidos. Tradicionalmente se ha utilizado para el crecimiento de células humanas linfoide. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y está formulado para su uso en una atmósfera de dióxido de carbono 5%. Hay una variedad de medios similares en la serie de RPMI, como RPMI 1640.

RPMI-1640 es un medio de cultivo que fue desarrollado por Moore et al. en el Roswell Park Memorial Institute, de ahí el acrónimo RPMI. La formulación se basa en el medio RPMI-1630 que utiliza un sistema amortiguador de bicarbonato y variaciones en las cantidades de aminoácidos y vitaminas. Es un medio que ha sido usado para el cultivo de leucocitos humanos normales y neoplásicas, y ha demostrado una amplia aplicabilidad para apoyar el crecimiento de muchos tipos de células en cultivo, incluyendo frescos linfocitos humanos.

• Suero Bovino Fetal (SBF) (inactivado por calor)
· El suero es comúnmente usado como un suplemento para el medio basal de crecimiento. Provee una amplia variedad de proteínas macromoleculares, nutrientes de bajo peso molecular, proteínas transportadoras, hormonas y factores de anclaje. Da una capacidad de buffer al medio y neutraliza componentes tóxicos. En algunas ocasiones se puede observar precipitado, este contiene fibrina (proteína que participa en el proceso de la coagulación) y lipoproteínas, estos precipitados son normales y no afectan el comportamiento. Para removerlo, se debe centrifugar el suero o dejar que decante para luego transferirlo cuidadosamente a otra botella estéril. Además, las repetidas congelaciones y descongelaciones del suero aumentan los precipitados por lo tanto no son recomendadas.

• Glutamina (aminoácido)
· La glutamina (abreviada Gln o Q) es uno de los 20 aminoácidos más comunes empleados en la codificación del código genético; es una cadena lateral de una amida del ácido glutámico, formada mediante el reemplazo del hidroxilo del ácido glutámico con un grupo funcional amina. Su función es sintetizar proteínas, aumentar el nitrógeno de la sangre, aumentar el ATP (Adenosina Trifosfato) y mejora el sistema inmune.
Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4º C).

• Penicilina/estreptomicina (antibióticos y antifúngicos)
· Participan como inhibidores del crecimiento de los contaminantes evitando el crecimiento de contaminantes en el cultivo, por lo que es, que se necesario suplementar con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción el medio de cultivo siendo estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.

• Fitohemaglutinina (PHA) (mitógeno)
· La Fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviación de Phytohaemagglutinin) es una lectina que corresponde al grupo de proteínas que reconocen carbohidratos y se caracterizan por su habilidad para combinarse con receptores de membrana de carbohidratos y formadas estructuralmente por un dominio tipo lectina y otro globular (reconoce a carbohidratos). Es reconocida por su capacidad para aglutinar eritrocitos y leucocitos y estimular inespecíficamente la proliferación de células T siendo esta característica mitogénica lo que le da su principal aplicación. Su función es participar como factor de crecimiento en el medio de cultivo.

• Muestra de sangre periférica total

· Corresponde a la sangre que circula por todo el cuerpo.

• Condiciones de cultivo

· En necesario cultivar la siembra de los linfocitos en condiciones óptimas que permitan su reproducción, es por eso, que se incuba en una estufa de cultivo bajo condiciones estrictas de temperatura (37ºC), concentración de CO2 (5%) y humedad (95%).

• Cultivo celular en suspensión
· Las líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación. Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de matrices que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular; éstas macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula. El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operación.

COSECHA

• Periodo de cultivo
· Para linfocitos humanos se requiere un periodo de incubación de 72 horas.

• Colcemid

· Es un inhibidor mitótico, análogo sintético de la colchicina y sumamente activo. Se añade tras el cultivo celular para inhibir la formación de uso acromático, división del centrómero, inhibir la mitosis y detener el ciclo celular detenido en metafase por degradación de los microtúbulos esenciales para el correcto proceso mitótico.

• KCl 0.075 M (1.398 g/250 ml) a 37º C
· Se incuba en esta solución con el objetivo de generar un movimiento de moléculas hacia en interior de la célula aumentando su volumen hasta provocar un shock hipotónico facilitando la ruptura de membranas y lisis celular en el goteo.

• Fijador Metanol/Ac. Acético 3:1 (Fijador Carnoy)
· Un fijador modifica una celula mediante la estabilización de las proteínas de modo que la hace resistente a los cambios posteriores. Carnoy es un fijador tipo coagulante que transforma las proteínas en estructuras insolubles mantienendo la morfología de las estructuras celulares a nivel de microscopía de luz.

• Goteo
· Proceso que consiste en tomar con una micropipeta, pipeta de vidrio o pipeta pasteur una cantidad pequeña de cultivo linfocitario ya procesado y dejar caer 1 o 2 gotas desde una distancia de aprox 50-60 cm sobre un portaobjetos limpio. La altura permite que la gota al entrar en contacto con la superficie del vidrio colapse y se liberen los cromosomas.

• Envejecimiento

· Se envejecen los preparados en una estufa por 1 noche a 65ºC o por 3 a 4 días a 37º C para que el fijador se evapore, las celulas se aplanen, los cromosomas comiencen a expandirse y el citoplasma disminuya.