INTRODUCCION
Microscopía de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbi
da como rayas luminosos.
Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores.
Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia.
Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado.
Epifluorescencia: Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio actúa como lente iluminadora y de imagen.
CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:
*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.
COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL
Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo.
Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la formación de la imagen. En este sentido la microscopía de fluorescencia difiere de la microscopía normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.
FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación. Ejemplo:
1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)
2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo .
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.
Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:
*El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que el largo de onda de la luz excitadora
*Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por lo tanto la energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.
*La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la luz de excitación
*La fluorescencia se desvanece.
*Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.
APLICACIONES
1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma.
2.Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante métodos de tinción. Ej:substancias específicas como organelos celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.
3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus.
TECNICAS DE TINCION FLUORESCENTE
1.DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.
Desventaja: No discrimina entre células vivas y muertas.
2. Tincion de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y muertas
Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, tintes se pueden pegar a otras cosas que no son células en muestras ambientales o complejas.
3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.
4. Autofluorescencia
Ej: Vitamina A, clorofila de cianobacterias
5. Fluorescencia inducida
6. Objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución de los lentes ópticos, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, virus
FLUORESCENCIA MULTIPLE
Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.
Microscopía de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbi
da como rayas luminosos.
Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores.
Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia.
Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado.
Epifluorescencia: Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio actúa como lente iluminadora y de imagen.
CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:
*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.
COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL
Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo.
Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la formación de la imagen. En este sentido la microscopía de fluorescencia difiere de la microscopía normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.
FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación. Ejemplo:
1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)
2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo .
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.
Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:
*El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que el largo de onda de la luz excitadora
*Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por lo tanto la energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.
*La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la luz de excitación
*La fluorescencia se desvanece.
*Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.
APLICACIONES1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma.
2.Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante métodos de tinción. Ej:substancias específicas como organelos celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.
3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus.
TECNICAS DE TINCION FLUORESCENTE
1.DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.
Desventaja: No discrimina entre células vivas y muertas.2. Tincion de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y muertas
Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, tintes se pueden pegar a otras cosas que no son células en muestras ambientales o complejas.3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.
4. AutofluorescenciaEj: Vitamina A, clorofila de cianobacterias
5. Fluorescencia inducida
6. Objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución de los lentes ópticos, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, virusFLUORESCENCIA MULTIPLE
Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.
