Una vez procesados los cortes estos todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color. Para poder resaltar los componentes celulares es que se realiza una reacción de tinción o coloración en donde una combinación de reacciones físicas y químicas permite identificar estructuras especificas dentro de las células.
Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintéticos, donde los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histológicos. Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo, conjunto de átomos de una molécula que le otorga color, y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y por lo tanto formar sales facilitando la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.
Existen colorantes ácidos, básicos y neutros. Los colorantes básicos están constituidos por un ion cargado [+] y un ion cargado [-] (Anilina++Cloruro-) y la tinción básica es aquella en que el color está dado por el ion cargado positivamente. Los colorantes ácidos están constituidos por un ion cargado [-] y un ion cargado [+] (Sodio++ Anilina-) y la tinción ácida es aquella en que el color está dado por el ion cargado negativamente.
Materiales y métodos
Órgano: Hígado de ratón.
Fijador: Formalina al 10% y Líquido de Bouin a temperatura ambiente durante 24 hrs.
Método: Hematoxilina & Eosina.
Tinción nuclear (Hematoxilina)
La Hematoxilina de Harris esta compuesta por una mezcla de Hematoxilina (5 g), Alcohol 100% (50 mL), Alumbre de Potasio (100 g), Agua destilada (1000 mL) y Oxido de rojo de Mercurio (2,5 g). Para su preparación primero se disolvió la Hematoxilina en Alcohol absoluto, por otro lado se calentó el agua en una platina caliente y se agrego el Alumbre de Potasio, una vez que se disolvió bien se agregó suavemente la Hematoxilina y se agitó con cuidado. Se colocó en la platina caliente nuevamente y una vez que hirvió, se retiró y dejó enfriar un poco, agregando con precaución en pequeñas cantidades el Oxido de Mercurio agitando con precaución y dejando que se entibiara para finalmente verter la solución en su envase definitivo. Cada uno de los componentes de la Hematoxilina cumple una función, el Agua destilada es solvente del mordiente, Alcohol 100% es solvente de la hematoxilina, Alumbre de potasio es mordiente, Oxido de Mercurio que oxida la Hematoxilina a Hemateina que es su ingrediente activo, y finalmente la Hematoxilina que es el colorante. La Hematoxilina dependiendo con los elementos que se mezcle puede formar compuestos con distintas características y afinidades a ciertas estructuras (Hematoxilina de Weigert, Verhoeff, Hendenhein, etc.), por lo que es un colorante de amplio uso en los procesos histológicos.
La Hematoxilina necesita de un mordiente (intermediario) entre el tejido y el colorante, formando un complejo Tejido-Mordiente-Hematoxilina, compuesto por un complejo de coordinación formado entre un ion polivalente de un metal y el colorante, que no es fácil disociarlo.
La Hematoxilina es un colorante básico que reacciona con los grupos aniónicos (cargados negativamente) de los componentes de los tejidos, como los grupos fosfato ionizados (PO3-) de la heterocromatina, nucléolos y ácidos nucleicos (ADN y RNA) del núcleo, grupos sulfato ionizados (SH-) del ergatoplasma (parte del citoplasma) y matriz del cartílago, y grupos carbonilo (COOH-) de las proteínas, por lo que son basófilos.
Tinción citoplasmática (Eosina)
La Eosina esta compuesta por una mezcla de Eosina Y (0,25 grs.) y Floxina B (0,25 grs.) en relación 1:1 más Agua destilada (100 mL), o bien, puede utilizarse Eosina al 1%.
La Eosina tiene la capacidad de dar coloraciones de distintas tonalidades al citoplasma dependiendo el tipo que sea como, lo es en este caso en, la Eosina Y da un tono rosa-amarillento y la Floxina B una coloración roja mas profunda, otro tipo es la Eosina B y Eritrosina B que dan un tono rosado-azulado.
La Eosina debido a su carácter ácido reacciona con los grupos catiónicos (cargados positivamente) de los componentes del tejido por medio de enlaces electroestáticos, como con los grupos amino ionizados (NH4+) de la mayor parte del citoplasma no especializado, filamentos citoplasmáticos y fibras extracelulares, por lo que son acidófilos.
Diferenciación
Para quitar el exceso de Hematoxilina se utiliza Alcohol Acido o Alcohol Clorhídrico al 0,5% que es un diferenciador compuesto por una mezcla de Alcohol etílico al 70% (100 mL) y Acido clorhídrico concentrado (1 mL).
La diferenciación es el proceso de remover el exceso de colorante de los tejidos para así lograr acentuar una estructura que retiene el tinte mientras que todo lo cercano está perdiendo la de ellos, esto lo hace con un alto grado de selectividad.
Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E)
Previamente a realizar la tinción primero se debe desparafinar e hidratar hasta el agua mediante los pasos de la Tabla N°1.
*Después de cada paso dejar escurrir el exceso de líquido.
Se realizaron los siguientes pasos para llevar a cabo el procedimiento de esta coloración de rutina:
1) Una vez que los cortes estaban hidratados se colocaron las láminas en la solución de Hematoxilina, en los tiempos indicados en la Tabla N°2.
2) Se lavaron los cortes en abundante agua corriente durante 5 minutos.
3) Se pasaron los cortes por agua destilada.
4) Se diferenciaron, como se indica en la Tabla N°2, las muestras con Alcohol Clorhídrico mediante inmersión controlando la intensidad de la tinción al microscopio.
5) Se lavaron en agua corriente durante 10 minutos.
6) Se lavaron en agua destilada con solo una pasada.
7) Se colocaron los cortes en una solución de Eosina, como se indica en la Tabla N°2, durante 30 seg. A 3 minutos.
8) Se lavó rápidamente en agua destilada solo para retirar el exceso de colorante.
9) Se pasaron las muestras por alcoholes ascendentes para deshidratar los cortes, siguiendo los pasos de la Tabla N°3.
10) Se pasaron las muestras por xiloles para aclarar los cortes, siguiendo los pasos de la Tabla N°4.
11) Se montaron las muestras en resina sintética.
Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintéticos, donde los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histológicos. Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo, conjunto de átomos de una molécula que le otorga color, y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y por lo tanto formar sales facilitando la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.
Existen colorantes ácidos, básicos y neutros. Los colorantes básicos están constituidos por un ion cargado [+] y un ion cargado [-] (Anilina++Cloruro-) y la tinción básica es aquella en que el color está dado por el ion cargado positivamente. Los colorantes ácidos están constituidos por un ion cargado [-] y un ion cargado [+] (Sodio++ Anilina-) y la tinción ácida es aquella en que el color está dado por el ion cargado negativamente.
Materiales y métodos
Órgano: Hígado de ratón.
Fijador: Formalina al 10% y Líquido de Bouin a temperatura ambiente durante 24 hrs.
Método: Hematoxilina & Eosina.
Tinción nuclear (Hematoxilina)
La Hematoxilina de Harris esta compuesta por una mezcla de Hematoxilina (5 g), Alcohol 100% (50 mL), Alumbre de Potasio (100 g), Agua destilada (1000 mL) y Oxido de rojo de Mercurio (2,5 g). Para su preparación primero se disolvió la Hematoxilina en Alcohol absoluto, por otro lado se calentó el agua en una platina caliente y se agrego el Alumbre de Potasio, una vez que se disolvió bien se agregó suavemente la Hematoxilina y se agitó con cuidado. Se colocó en la platina caliente nuevamente y una vez que hirvió, se retiró y dejó enfriar un poco, agregando con precaución en pequeñas cantidades el Oxido de Mercurio agitando con precaución y dejando que se entibiara para finalmente verter la solución en su envase definitivo. Cada uno de los componentes de la Hematoxilina cumple una función, el Agua destilada es solvente del mordiente, Alcohol 100% es solvente de la hematoxilina, Alumbre de potasio es mordiente, Oxido de Mercurio que oxida la Hematoxilina a Hemateina que es su ingrediente activo, y finalmente la Hematoxilina que es el colorante. La Hematoxilina dependiendo con los elementos que se mezcle puede formar compuestos con distintas características y afinidades a ciertas estructuras (Hematoxilina de Weigert, Verhoeff, Hendenhein, etc.), por lo que es un colorante de amplio uso en los procesos histológicos.
La Hematoxilina necesita de un mordiente (intermediario) entre el tejido y el colorante, formando un complejo Tejido-Mordiente-Hematoxilina, compuesto por un complejo de coordinación formado entre un ion polivalente de un metal y el colorante, que no es fácil disociarlo.
La Hematoxilina es un colorante básico que reacciona con los grupos aniónicos (cargados negativamente) de los componentes de los tejidos, como los grupos fosfato ionizados (PO3-) de la heterocromatina, nucléolos y ácidos nucleicos (ADN y RNA) del núcleo, grupos sulfato ionizados (SH-) del ergatoplasma (parte del citoplasma) y matriz del cartílago, y grupos carbonilo (COOH-) de las proteínas, por lo que son basófilos.
Tinción citoplasmática (Eosina)
La Eosina esta compuesta por una mezcla de Eosina Y (0,25 grs.) y Floxina B (0,25 grs.) en relación 1:1 más Agua destilada (100 mL), o bien, puede utilizarse Eosina al 1%.
La Eosina tiene la capacidad de dar coloraciones de distintas tonalidades al citoplasma dependiendo el tipo que sea como, lo es en este caso en, la Eosina Y da un tono rosa-amarillento y la Floxina B una coloración roja mas profunda, otro tipo es la Eosina B y Eritrosina B que dan un tono rosado-azulado.
La Eosina debido a su carácter ácido reacciona con los grupos catiónicos (cargados positivamente) de los componentes del tejido por medio de enlaces electroestáticos, como con los grupos amino ionizados (NH4+) de la mayor parte del citoplasma no especializado, filamentos citoplasmáticos y fibras extracelulares, por lo que son acidófilos.
Diferenciación
Para quitar el exceso de Hematoxilina se utiliza Alcohol Acido o Alcohol Clorhídrico al 0,5% que es un diferenciador compuesto por una mezcla de Alcohol etílico al 70% (100 mL) y Acido clorhídrico concentrado (1 mL).
La diferenciación es el proceso de remover el exceso de colorante de los tejidos para así lograr acentuar una estructura que retiene el tinte mientras que todo lo cercano está perdiendo la de ellos, esto lo hace con un alto grado de selectividad.
Tinción Hematoxilina-Eosina (H&E)
Previamente a realizar la tinción primero se debe desparafinar e hidratar hasta el agua mediante los pasos de la Tabla N°1.
Tabla N°1: Pasos para desparafinar y hidratar las muestras
*Después de cada paso dejar escurrir el exceso de líquido.Se realizaron los siguientes pasos para llevar a cabo el procedimiento de esta coloración de rutina:
1) Una vez que los cortes estaban hidratados se colocaron las láminas en la solución de Hematoxilina, en los tiempos indicados en la Tabla N°2.
2) Se lavaron los cortes en abundante agua corriente durante 5 minutos.
3) Se pasaron los cortes por agua destilada.
4) Se diferenciaron, como se indica en la Tabla N°2, las muestras con Alcohol Clorhídrico mediante inmersión controlando la intensidad de la tinción al microscopio.
5) Se lavaron en agua corriente durante 10 minutos.
6) Se lavaron en agua destilada con solo una pasada.
7) Se colocaron los cortes en una solución de Eosina, como se indica en la Tabla N°2, durante 30 seg. A 3 minutos.
8) Se lavó rápidamente en agua destilada solo para retirar el exceso de colorante.
Tabla N°2: Procedimiento de tinción Hematoxilina-Eosina en Hígado de ratón.
9) Se pasaron las muestras por alcoholes ascendentes para deshidratar los cortes, siguiendo los pasos de la Tabla N°3.
Tabla N°3: Deshidratación de las muestras
10) Se pasaron las muestras por xiloles para aclarar los cortes, siguiendo los pasos de la Tabla N°4.
Tabla N°4: Aclaramiento de las muestras
11) Se montaron las muestras en resina sintética.
