El fundamento de este método se basa en la identificación de ácidos nucleicos tanto del DNA como RNA a partir del reconocimiento de grupos fosfatos. Esta técnica utiliza 2 colorantes cationicos(+) aplicados simultáneamente bajo condiciones, cuidadosamente controladas, de concentración y pH, en un rango de 4,0-4,6 siendo 4,0 el medio más óptimo para la mayoría de los materiales. Se basa fundamentalmente en la forma y tamaño de las moléculas del colorante que determinan cual será el color impartido a cada uno de los ácidos nucleicos.
La amplia configuración en hélice del catión del Verde de Metilo le otorga un mayor carácter catiónico, por lo que, es atraído electroestáticamente a los grupos fosfatos en el lado externo de la cadena de DNA y es mantenido en esta posición por ayuda de las uniones no iónicas a las pentosas del DNA y las nucleoproteínas asociadas, demostrando que posee una mayor afinidad por moléculas mas polimerizadas, favorecido por una alta estereoespecificidad por parte de la molécula de colorante hacia las moléculas de la cadena de DNA.
La Pironina Y posee un leve carácter catiónico, una alta afinidad a zonas menos polimerizadas y una estructura planar que se intercala entre los pares de bases de los ácidos nucleicos y no logra entrar al DNA porque sus iones son excluidos por el Verde de Metilo en el lado externo de la cadena, por lo que, se une al RNA que al ser una estructura más abierta, admite fácilmente los cationes de la Pironina Y los cuales se intercalan firmemente entre los pares de bases, neutralizan los fosfatos y excluyen al Verde de Metilo que no se puede intercalar.
Los resultados son una tinción de cromatina (DNA) azul verdoso, nucléolo (RNA) rojo brillante y RNA citoplasmático rojo.
En el método de Verde de Metilo Pironina Y, donde se utilizan 2 colorantes catiónicos, otros materiales más basofílicos que los ácidos nucleicos pueden ser teñidos principalmente por la Pironina Y u otros cromógenos planares catiónicos, por lo que, es necesario realizar un tratamiento de extracción, químico o enzimático, a las muestras de tejido para verificar la especificidad de la tinción, especialmente en el caso del RNA. Su mecanismo se caracteriza más por la selectividad de los colorantes hacia DNA (Verde de Metilo) y RNA (Pironina Y) que por su especificidad hacia los ácidos nucleicos.
El Verde de Metilo suele estar contaminado con trazas de Violeta de Metilo, por lo que, al prepararlo tiene que ser purificado decantándose en una solución acuosa de cloroformo, ya que el Violeta de Metilo es soluble en él, hasta que formen dos fases y eliminar la fase inferior, que posee el cloroformo con el Violeta de Metilo disuelto en el, hasta que se observe transparente.
Bibliografía: Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
La amplia configuración en hélice del catión del Verde de Metilo le otorga un mayor carácter catiónico, por lo que, es atraído electroestáticamente a los grupos fosfatos en el lado externo de la cadena de DNA y es mantenido en esta posición por ayuda de las uniones no iónicas a las pentosas del DNA y las nucleoproteínas asociadas, demostrando que posee una mayor afinidad por moléculas mas polimerizadas, favorecido por una alta estereoespecificidad por parte de la molécula de colorante hacia las moléculas de la cadena de DNA.
La Pironina Y posee un leve carácter catiónico, una alta afinidad a zonas menos polimerizadas y una estructura planar que se intercala entre los pares de bases de los ácidos nucleicos y no logra entrar al DNA porque sus iones son excluidos por el Verde de Metilo en el lado externo de la cadena, por lo que, se une al RNA que al ser una estructura más abierta, admite fácilmente los cationes de la Pironina Y los cuales se intercalan firmemente entre los pares de bases, neutralizan los fosfatos y excluyen al Verde de Metilo que no se puede intercalar.
Los resultados son una tinción de cromatina (DNA) azul verdoso, nucléolo (RNA) rojo brillante y RNA citoplasmático rojo.
En el método de Verde de Metilo Pironina Y, donde se utilizan 2 colorantes catiónicos, otros materiales más basofílicos que los ácidos nucleicos pueden ser teñidos principalmente por la Pironina Y u otros cromógenos planares catiónicos, por lo que, es necesario realizar un tratamiento de extracción, químico o enzimático, a las muestras de tejido para verificar la especificidad de la tinción, especialmente en el caso del RNA. Su mecanismo se caracteriza más por la selectividad de los colorantes hacia DNA (Verde de Metilo) y RNA (Pironina Y) que por su especificidad hacia los ácidos nucleicos.
El Verde de Metilo suele estar contaminado con trazas de Violeta de Metilo, por lo que, al prepararlo tiene que ser purificado decantándose en una solución acuosa de cloroformo, ya que el Violeta de Metilo es soluble en él, hasta que formen dos fases y eliminar la fase inferior, que posee el cloroformo con el Violeta de Metilo disuelto en el, hasta que se observe transparente.
Bibliografía: Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice, J.A. Kiernan, Third Edition, 1999.
