Aunque son muy similares a las funciones de fijador, las acciones fijadoras pueden ser consideradas un tema aparte. Las enzimas, que son proteínas, son desactivadas como consecuencia de la estabilización de las proteínas por de acción del fijador. Esta es una característica fijadora muy importante, como la acción enzimática causa la autólisis del tejido. Los tejidos que son ricos en enzimas, por ejemplo hígado, páncreas y cerebro, son más susceptibles a la autólisis rápida que los tejidos con un predominio de las fibras conectivas de tejido. Los fijadores también matan las bacterias y mohos, que causan putrefacción. Los fijadores hacen que el tejido se vuelva más receptivo para tinciones y, en muchas instancias, actúan como mordientes, que sirven para vincular el colorante con el tejido. Los fijadores modifican los componentes de los tejidos para la máxima retención de la forma durante los pasos posteriores del proceso. Esta es una acción muy importante porque los pasos posteriores a la fijación pueden inducir un cambio dramático en los tejidos. El fijador debe estabilizar los elementos del tejido a fin de que los efectos de cualquier procedimiento posterior sean mínimos.
Hay métodos físicos y químicos de estabilizar proteínas. Uno de los métodos físicos es usar calor. El calor estabilizará y desnaturalizará la proteína, como se demuestra cocinando un huevo. La fijación por calor generalmente no ha sido usada en el laboratorio del histopatología, pero con la llegada del horno de microondas, se han encontrado muchos mas usos. Los hornos de microondas son un tipo de radiación no ionizante. Cuando las moléculas dipolares (cargadas), como el agua o las cadenas polares laterales de las proteínas, están expuestas a las microondas, las moléculas oscilan, dan vueltas hacia atrás o hacia adelante, a razón de 2,5 billones de veces por segundo. El resultado es la fricción molecular o calor instantáneo. El calor producido es controlado por el ajuste de los niveles de energía de las microondas y la duración de la exposición. Se puede usar la fijación por microondas en uno o dos pasos. En la fijación por dos pasos, el primero consiste en la fijación por inmersión en solución salina de grandes ejemplares como el estómago, órganos sólidos, y segmentos groseros, y el segundo paso consiste en la fijación de los bloques de 2 mm de espesor inmersos en solución salina y se calienta a una temperatura de 50°C a 60°C o 45°C a 55°C. Estos rangos de temperatura son críticos; si la temperatura se permite para exceder estos rangos o un máximo de 68°C, el tejido mostrara núcleos picnóticos y sobre teñidos. Hopwood dice que la desnaturalización de proteínas que se produce con el sobrecalentamiento también puede causar una pérdida de la actividad enzimática y antigenicidad, falsa localización de los ácidos nucleicos, y frecuentemente lisis de los glóbulos rojos. Si la temperatura usada es demasiado baja, dará como resultado una mala fijación. Aunque la solución salina es más ampliamente utilizada para la fijación por microondas, los aldehídos también han sido usados.
La desecación es otro método físico de fijar proteínas, pero la desecación es raramente, si alguna vez, usada en rutina en histopatología. Sistema de secado de preparaciones para la tinción de Wright es probablemente la utilización más frecuente de este método de fijación. El método principal de estabilización de proteínas en el laboratorio de histopatología implica el uso de uno o más reactivos químicos. Estos reactivos pueden ser clasificados como aditivos o no aditivos y coagulantes y no coagulantes. Los fijadores aditivos forman enlaces químicos, o se suman ellos mismos, con el tejido y los cambian con esta acción. Cuando una molécula fijativa se añade encima de una macromolécula del tejido, la carga eléctrica en el sitio adjunto puede ser cambiada. Si la carga eléctrica cambia, y esta fuerza ayuda a mantener la conformación, o molde, de la proteína, entonces la estructura terciaria puede estar significativamente alterada. Los reactivos aditivos comunes son cloruro de mercurio, trióxido de cromo, ácido pícrico, formaldehído, glutaraldehído, tetróxido de osmio, sulfato de zinc o cloruro. Los fijadores no aditivos, son compuestos predominantemente orgánicos, como la acetona y los alcoholes, actúan sobre tejido sin combinarse químicamente con él.
Por ejemplo, alcoholes metílicos y etílicos precipitan o coagulan proteínas pero no se añaden a los tejidos. El mecanismo principal por el cual estos fijadores actúan es por la disociación obligada de las moléculas de agua de los grupos de proteínas desde el tejido. Como resultado, esto puede provocar el encogimiento y endurecimiento si se produce la sobre exposición.
Los grupo amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) de las proteínas son muy importantes para la coloración. Si el fijador se añade por si mismo en uno de estos grupos, la tinción de los tejidos será notablemente afectada. A un pH de 7.0, el formaldehído se añade a las proteínas de los tejidos principalmente al grupo amino, con la formación eventual de un puente metilénico. Esto da como resultado un exceso de de cargas negativas en las proteínas. Los metales pesados (cromo, mercurio y osmio) son cationes (cargados positivamente) que se combinan con grupos aniónicos (cargados negativamente) de las proteínas. Esto se traduce en un exceso de cargas positivas. Alguno de esos grupos que se combinan con aniones son sulfhídrico (-SH), carbonilo (-COOH) y acido fosfórico (-PO4).
Para comprender mejor la acción coagulante y no coagulante de los fijadores, imagine dos platos, uno con un trozo de gelatina y el otro con una malla en forma de pelota. ¿Cual de los dos platos el agua penetraría o entraría mas libremente? El agua entraría más fácilmente en todas las grietas de la malla, pero tendría dificultad para entrar en la gelatina. La coagulación establece una red en el tejido que le permite a las soluciones penetrar fácilmente o conseguir entrar en el interior del tejido. Los fijadores no coagulantes actúan creando un gel que hace que la penetración de las soluciones posteriores sea difícil. Debido a que los fijadores no coagulantes no permiten una buena penetración de los reactivos aplicados después de la fijación, Baker consideraba a estos fijadores inferiores para la impregnación e inclusión en parafina. Para usar después de un fijador no coagulante, los medios de infiltración o inclusiones que no fueran parafina funcionaban mejor.
Los fijadores no coagulantes son:
Formaldehído / Glutaraldehído / Tetróxido de osmio / Dicromato de potasio / Acido acético
Los fijadores coagulantes son:
Alcoholes / Sales de zinc / Cloruro de mercurio / Trióxido de cromo / Acido pícrico
Bibliografía
