Bandeo G (Lacadena, Aguilar, Vives y Guizar)
La técnica de bandeo cromosómico consiste en someter a los cromosomas a desnaturalizaciones, digestión enzimática o ambos, seguido de una tinción con colorante específico para ADN. Esto hace que los cromosomas se tiñan con una serie de bandas claras y oscuras. El patrón de Bandeo de los cromosomas teñidos por la técnica de bandeo G presentan bandas claras y oscuras a lo largo del cromosoma, su número depende del grado de desespiralización de los cromosomas y es muy similar al que se obtiene por bandas Q.El mecanismo de bandeo aún no se conoce por completo, sin embargo, en 1978 Commings sugirió que el bandeo ocurre por la presencia intrínseca de cromómeros en el cromosoma, los cuales forman un patrón de bandeo fundamental que revelan varias técnicas de tinción diferencial. Por otro lado, como se revela específicamente cuando se aplica el pretratamiento con tripsina (bandas GTG) o con calor (GHG), se sugiere que el pretratamiento rearregla la cromatina dejando surcos de digestión que permiten captar el colorante de Giemsa. También debido a que se puede obtener un patrón de bandeo G cuando se utilizan agentes que digieren, desnaturalizan y oxidan proteínas se postula que la cromatina se reorganiza por alteración de proteínas histonas tanto del octámero como de H1. Esto se comprueba en la práctica, ya que, al fijar con aldehído o agentes que hacen uniones cruzadas entre proteínas-proteína y proteína-DNA, no aparecen las bandas G.
Es la técnica más usada proporcionando una secuencia nítida de bandas claras y oscuras con la ventaja de ser permanente y observable al microscopio de luz permitiendo:
· Corroborar alteraciones cromosómicas previstas antes por el cuadro clínico.
· Identificar cromosomas o regiones cromosómicas implicadas en rearreglos evidentes con tinción homohénea para dar un asesoramiento genético adecuado.
· Detectar aberraciones estructurales que podrían pasar desapercibidas con la técnica de tinción homogénea.
· Hacer correlación cariotipo-fenotipo y delinear nuevos síndromes cromosómicos.
· Localización y mapeo de genes en cromosomas y bandas específicas.
· Bandeo G es la técnica que en todo el mundo se usa como referencia de la diferenciación longitudinal de los cromosomas.
SEGÚN LACADENA las preparaciones de cromosomas, en un comienzo, se incuban en algún tipo de solución salina (solución salina de citrato SSC) con o sin tratamiento previo con un álcali, y se tiñen luego con Giemsa (mezcla de tintes derivados de la tiazina y eosina) (Summer et al. 1971). Muchas veces antes de la tinción se da un tratamiento suave con proteasas como la tripsina (Seabright, 1971).En cuanto a la interpretación las bandas positivas (oscuras) o negativas (claras) se producen por diferencias en las proteínas cromosómicas, donde, las bandas positivas corresponden a regiones ricas en puentes disulfuro (-S-S-) y las negativas a regiones ricas en proteínas con grupos sulfidrilos (-SH). Esta técnica debe realizarse en la etapa de metafase donde la tinción se hace uniforme por fusión de las bandas, desapareciendo las bandas negativas.
SEGÚN AGUILAR Y VIVES el protocolo general a seguir para Bandeo G es el siguiente:
· Envejecer las preparaciones en la estufa de desecación a 65° C durante 24 horas o sobre una placa a 100° durante 1 hora, luego, pasado este tiempo ya se pueden teñir.
· Realizar la tinción, para lo que se mezclan 3 partes de tampón Sörensen con una parte del colorante de Wright. Por cada porta se usan 3 ml de buffer y 1 ml de colorante. La mezcla se prepara en el momento de realizar la tinción y se deja actuar sobre los portas durante 2-3 minutos. La cantidad de mezcla que sobre se desecha porque el colorante de Wright precipita al rato de haberse añadido el tampón.
· Para esto se tiene que preparar el colorante Wright del siguiente modo:
1. Se prepara una solución al 0,25% de colorante de Wright en metanol (normalmente se preparan 500 ml) y se agita la mezcla 1 hora en una botella preservada de la luz.
2. Se filtra con papel filtro y se guarda a 37° C durante 72 horas.Una vez preparado se conserva a 4° C.
El Buffer Sörensen se prepara como sigue:Fosfato potásico 4,539 g. + Fosfato sódico 5,938 g. + 3. 1000 ml de agua destilada.Una vez preparado, se conserva a 4° C.
· En cuanto al análisis e interpretación de los resultados se localizan las metafases con el objetivo 10x, se añade aceite de inmersión sobre el portaobjetos y se valoran las metafases con el objetivo 100x. Luego se realiza el recuento de cromosomas de cada metafase y se ordenan por pares los cromosomas (22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales) en un mínimo de 20 metafases y el cariotipado en un mínimo de cinco metafases.
SEGÚN GUIZAR Y COLABORADORES el protocolo paso a paso a seguir para la aplicación de la técnica de Bandeo G con tripsina (GTG) es el siguiente:
1. Los portaobjetos madurados un día a temperatura ambiente y si se desea se pueden hacer las bandas inmediatamente después de que el cultivo haya salido.
2. Se tratan las portaobjetos con una solución de tripsina a 0.05% de 60-90 segundos, en baño María a 37° C.
3. Se enjuaga en solución salina isotónica.
4. Se tiñe en solución de fosfatos Giemsa pH 6.8, por tres minutos y medio.
5. Se lava con agua tibia destilada y se deja secar al aire.
6. Los portaobjetos se pueden observar sin cubrirlas o cubriéndolas con una gota de amortiguador fosfato pH 6.87.
En caso de que no se observen bandas, se puede desteñir con alcohol a 70% o con fijador y volver a realizar el procedimiento desde el paso 2.
El uso de tripsina debe ser cuidadoso, ya que puede contaminarse con facilidad y decaer su actividad enzimática y, por tanto, puede generar un bandeo erróneo.
Las soluciones que se necesitan se preparan de la siguiente forma:
a) Solución de Tripsina: se pesan 0.1 g de tripsina y 0.02 g de EDTA, y se afora en 10 mL de agua destilada. Se hacen alícuotas de 1 mL y se guardan en congelación hasta su uso.
b) Solución salina isotónica: Cloruro de sodio a 0.9%.
c) Solución amortiguadora: fosfato 0.025 M. Se pesan 3.549 g de fosfato de sodio no hidratado, se afora en 1000 mL de agua desionizada; se pesan 3.402 g de fosfato de potasio, y se afora en 1000 mL de agua desionizada.
d) Colorante de Giemsa: se toman 23 mL de amortiguador de fosfatos de potasio, y adicionan 4 mL de una solución madre de colorante Giemsa.
Bibliografía
· Aguilar Bascompte, Josep Lluís y Vives Corrons, Joan Lluís, Hematología: Técnicas y procedimientos de laboratorio, Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltda., 3ra Edición, 1996, Capítulo 14, pp 334-335.
· Juan-Ramón Lacadena, Citogenética, Editorial Complutense, 1996, Capítulo 3, pp 84.
· J. Jesús Guízar Vázquez y colaboradores, Genética clínica: diagnóstico y manejo de las enfermedades hereditarias, México, D.F.: El Manual Moderno, Edición 3ra Edición, 2001, Capítulo 10, pp 157, 158, 171 y 172.
La técnica de bandeo cromosómico consiste en someter a los cromosomas a desnaturalizaciones, digestión enzimática o ambos, seguido de una tinción con colorante específico para ADN. Esto hace que los cromosomas se tiñan con una serie de bandas claras y oscuras. El patrón de Bandeo de los cromosomas teñidos por la técnica de bandeo G presentan bandas claras y oscuras a lo largo del cromosoma, su número depende del grado de desespiralización de los cromosomas y es muy similar al que se obtiene por bandas Q.El mecanismo de bandeo aún no se conoce por completo, sin embargo, en 1978 Commings sugirió que el bandeo ocurre por la presencia intrínseca de cromómeros en el cromosoma, los cuales forman un patrón de bandeo fundamental que revelan varias técnicas de tinción diferencial. Por otro lado, como se revela específicamente cuando se aplica el pretratamiento con tripsina (bandas GTG) o con calor (GHG), se sugiere que el pretratamiento rearregla la cromatina dejando surcos de digestión que permiten captar el colorante de Giemsa. También debido a que se puede obtener un patrón de bandeo G cuando se utilizan agentes que digieren, desnaturalizan y oxidan proteínas se postula que la cromatina se reorganiza por alteración de proteínas histonas tanto del octámero como de H1. Esto se comprueba en la práctica, ya que, al fijar con aldehído o agentes que hacen uniones cruzadas entre proteínas-proteína y proteína-DNA, no aparecen las bandas G.
Es la técnica más usada proporcionando una secuencia nítida de bandas claras y oscuras con la ventaja de ser permanente y observable al microscopio de luz permitiendo:
· Corroborar alteraciones cromosómicas previstas antes por el cuadro clínico.
· Identificar cromosomas o regiones cromosómicas implicadas en rearreglos evidentes con tinción homohénea para dar un asesoramiento genético adecuado.
· Detectar aberraciones estructurales que podrían pasar desapercibidas con la técnica de tinción homogénea.
· Hacer correlación cariotipo-fenotipo y delinear nuevos síndromes cromosómicos.
· Localización y mapeo de genes en cromosomas y bandas específicas.
· Bandeo G es la técnica que en todo el mundo se usa como referencia de la diferenciación longitudinal de los cromosomas.
SEGÚN LACADENA las preparaciones de cromosomas, en un comienzo, se incuban en algún tipo de solución salina (solución salina de citrato SSC) con o sin tratamiento previo con un álcali, y se tiñen luego con Giemsa (mezcla de tintes derivados de la tiazina y eosina) (Summer et al. 1971). Muchas veces antes de la tinción se da un tratamiento suave con proteasas como la tripsina (Seabright, 1971).En cuanto a la interpretación las bandas positivas (oscuras) o negativas (claras) se producen por diferencias en las proteínas cromosómicas, donde, las bandas positivas corresponden a regiones ricas en puentes disulfuro (-S-S-) y las negativas a regiones ricas en proteínas con grupos sulfidrilos (-SH). Esta técnica debe realizarse en la etapa de metafase donde la tinción se hace uniforme por fusión de las bandas, desapareciendo las bandas negativas.
SEGÚN AGUILAR Y VIVES el protocolo general a seguir para Bandeo G es el siguiente:
· Envejecer las preparaciones en la estufa de desecación a 65° C durante 24 horas o sobre una placa a 100° durante 1 hora, luego, pasado este tiempo ya se pueden teñir.
· Realizar la tinción, para lo que se mezclan 3 partes de tampón Sörensen con una parte del colorante de Wright. Por cada porta se usan 3 ml de buffer y 1 ml de colorante. La mezcla se prepara en el momento de realizar la tinción y se deja actuar sobre los portas durante 2-3 minutos. La cantidad de mezcla que sobre se desecha porque el colorante de Wright precipita al rato de haberse añadido el tampón.
· Para esto se tiene que preparar el colorante Wright del siguiente modo:
1. Se prepara una solución al 0,25% de colorante de Wright en metanol (normalmente se preparan 500 ml) y se agita la mezcla 1 hora en una botella preservada de la luz.
2. Se filtra con papel filtro y se guarda a 37° C durante 72 horas.Una vez preparado se conserva a 4° C.
El Buffer Sörensen se prepara como sigue:Fosfato potásico 4,539 g. + Fosfato sódico 5,938 g. + 3. 1000 ml de agua destilada.Una vez preparado, se conserva a 4° C.
· En cuanto al análisis e interpretación de los resultados se localizan las metafases con el objetivo 10x, se añade aceite de inmersión sobre el portaobjetos y se valoran las metafases con el objetivo 100x. Luego se realiza el recuento de cromosomas de cada metafase y se ordenan por pares los cromosomas (22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales) en un mínimo de 20 metafases y el cariotipado en un mínimo de cinco metafases.
SEGÚN GUIZAR Y COLABORADORES el protocolo paso a paso a seguir para la aplicación de la técnica de Bandeo G con tripsina (GTG) es el siguiente:
1. Los portaobjetos madurados un día a temperatura ambiente y si se desea se pueden hacer las bandas inmediatamente después de que el cultivo haya salido.
2. Se tratan las portaobjetos con una solución de tripsina a 0.05% de 60-90 segundos, en baño María a 37° C.
3. Se enjuaga en solución salina isotónica.
4. Se tiñe en solución de fosfatos Giemsa pH 6.8, por tres minutos y medio.
5. Se lava con agua tibia destilada y se deja secar al aire.
6. Los portaobjetos se pueden observar sin cubrirlas o cubriéndolas con una gota de amortiguador fosfato pH 6.87.
En caso de que no se observen bandas, se puede desteñir con alcohol a 70% o con fijador y volver a realizar el procedimiento desde el paso 2.
El uso de tripsina debe ser cuidadoso, ya que puede contaminarse con facilidad y decaer su actividad enzimática y, por tanto, puede generar un bandeo erróneo.
Las soluciones que se necesitan se preparan de la siguiente forma:
a) Solución de Tripsina: se pesan 0.1 g de tripsina y 0.02 g de EDTA, y se afora en 10 mL de agua destilada. Se hacen alícuotas de 1 mL y se guardan en congelación hasta su uso.
b) Solución salina isotónica: Cloruro de sodio a 0.9%.
c) Solución amortiguadora: fosfato 0.025 M. Se pesan 3.549 g de fosfato de sodio no hidratado, se afora en 1000 mL de agua desionizada; se pesan 3.402 g de fosfato de potasio, y se afora en 1000 mL de agua desionizada.
d) Colorante de Giemsa: se toman 23 mL de amortiguador de fosfatos de potasio, y adicionan 4 mL de una solución madre de colorante Giemsa.
Bibliografía
· Aguilar Bascompte, Josep Lluís y Vives Corrons, Joan Lluís, Hematología: Técnicas y procedimientos de laboratorio, Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltda., 3ra Edición, 1996, Capítulo 14, pp 334-335.
· Juan-Ramón Lacadena, Citogenética, Editorial Complutense, 1996, Capítulo 3, pp 84.
· J. Jesús Guízar Vázquez y colaboradores, Genética clínica: diagnóstico y manejo de las enfermedades hereditarias, México, D.F.: El Manual Moderno, Edición 3ra Edición, 2001, Capítulo 10, pp 157, 158, 171 y 172.
