Cultivo de linfocitos, Cariotipo, Cromatina Sexual y Bandeo
Para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes (como el EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una suspensión celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido. La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”). Un cultivo celular es un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro.Permite observar cromosomas en preparaciones en metafase.
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares:conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto. Los CultivosSecundarios son si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo). La heterogeneidad celular es menor.
Utilidad
· Análisis de cromosomas in vitro
· Alteraciones cromosomicas
· Numéricas
· Estructurales
· Diagnóstico y terapia citogenética
Todos los seres humanos tienen 22 pares de cromosomas iguales, denominados autosomas, y un par de cromosomas diferentes según el sexo del individuo, los cromosomas sexuales o heterocromosomas. Los cromosomas de cada especie poseen una serie de características, como la forma, el tamaño, la posición del centrómero y las bandas que presentan al teñirse. Este conjunto de particularidades, que permite identificar los cromosomas de las distintas especies, recibe el nombre de cariotipo, y su representación gráfica, ordenada por parejas de cromosomas homólogos, se denomina cariograma.
Es recomendable realizar un cariotipo de un individuoen los casos que a continuación se exponen:
· Para confirmar síndromes congénitos.
· Cuando se observan algunas anomalíasespecíficas o que pueden estar relacionadas con los heterocromosomas.
· En situaciones de abortos repetidos, problemasde esterilidad.
Mediante el estudio del cariotipo es posible detectar anomalías en el número o en la forma de los cromosomas. La mayoría de estas anomalías provocan deficiencias, y muchos individuos no llegan a nacer o mueren en los primeros meses de vida. La determinación del cariotipo del feto permite detectar, antes del nacimiento, algunas de estas deficiencias.
En algunas especies los pares cromosómicos no pueden diferenciarse claramente considerando sólo sus componentes distintivos en sentido longitudinal; en estos casos se debe recurrir a técnicas citológicas especiales para la tinción de los cromosomas, que evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) a lo largo de los mismos, y que corresponden a los distintos tipos de cromatina. En una especie dada, estas variantes de la cromatina presentan un tamaño y disposición constante. Las técnicas de bandeo cromosómico más usadas son:
·Bandeo C: es relativamente sencilla, y se basa en el uso del colorante Giemsa que tiñe regiones con heterocromatina constitutiva, que en vegetales se halla localizada principalmente en regiones teloméricas, mientras que en animales, se encuentra en regiones centroméricas.
·Bandeos G, R, Q: son técnicas basadas en tratamientos enzimáticos que ponen de manifiesto distintos patrones de bandas de la eucromatina a lo largo del cromosoma. El material se tiñe con colorante Giemsa (G, R) ó colorantes fluorescentes, como laquinacrina (Q). Son las bandas más estudiadas en animales y en el hombre. En los vegetales son muy difíciles de obtener por el alto grado de empaquetamiento de los cromosomas metafásicos.
·Bandeo NOR: permite identificar cromatina con secuencias medianamente repetidas de ADNr, asociada a las regiones NOR del cromosoma. El número total y localización de las regiones NOR es variable, por lo cual, como ya se expresó, además de su importancia funcional tiene valor cariotípico.
La cromatina X se define como un pequeño cuerpo intranuclear, de forma plano convexa y de 0.7 a 1.2 de diámetro. El corpúsculo de Barr puede ser único o múltiple y en éste último caso se debe al exceso de cromosomas X en un individuo. Cada cromatina X corresponde a un cromosoma X heteropicnótico y que replica su DNA más tardíamente que el resto de los cromosomas. En ocasiones se observan cuerpos de Barr de tamaño o forma anormal y esto se debe a anomalías estructurales de uno de los cromosomas X. El cuerpo de Barr puede estudiarse en tres tipos de células: Células nerviosas, Células epiteliales y Leucocitos polimorfonucleares; y la manera de estudiarse es en el epitelio de la mucosa bucal es el tejido más adecuado para la demostración de la cromatina sexual.
Los cuerpos cromatínicos sexuales no solo distinguen a las células femeninas normales de las masculinas, si no que también son útiles para diagnosticar varios tipos de anomalías en los cromosomas sexuales de los seres humanos. En ciertos cromosomas se relacionan directamente con el número de cuerpos cromáticos sexuales; quienes poseen dos o más cromosomas X presentan un cuerpo cromatínico menos que el número de cromosomas X presentes.
Referencias
· Lodish, H. et. al. Biología celular y molecular.5° ed. Edit. Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2008. pp. 234-243.
· McKee, T. Bioquímica. 3° ed. Edit. McGraw-Hill. Edit. Interamericana.
· Novo Villaverde FJ. Genética Humana.Conceptos, mecanismos y aplicaciones de lagenética en el campo de la biomedicina.Editorial Pearson. Madrid, España. 2007.
· Lynch MJ. Et al. Métodos de Laboratorio. 2daedición. Vol.2. Editorial Interamericana.México. 1977.
· http://www.scribd.com/doc/14671166/Cultivo-de-linfocitos-Cromatina-Sexual-y-Cariotipo
Para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan agentes (como el EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una suspensión celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido. La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción de moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”). Un cultivo celular es un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro.Permite observar cromosomas en preparaciones en metafase.
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares:conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto. Los CultivosSecundarios son si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo). La heterogeneidad celular es menor.
Utilidad
· Análisis de cromosomas in vitro
· Alteraciones cromosomicas
· Numéricas
· Estructurales
· Diagnóstico y terapia citogenética
Todos los seres humanos tienen 22 pares de cromosomas iguales, denominados autosomas, y un par de cromosomas diferentes según el sexo del individuo, los cromosomas sexuales o heterocromosomas. Los cromosomas de cada especie poseen una serie de características, como la forma, el tamaño, la posición del centrómero y las bandas que presentan al teñirse. Este conjunto de particularidades, que permite identificar los cromosomas de las distintas especies, recibe el nombre de cariotipo, y su representación gráfica, ordenada por parejas de cromosomas homólogos, se denomina cariograma.
Es recomendable realizar un cariotipo de un individuoen los casos que a continuación se exponen:
· Para confirmar síndromes congénitos.
· Cuando se observan algunas anomalíasespecíficas o que pueden estar relacionadas con los heterocromosomas.
· En situaciones de abortos repetidos, problemasde esterilidad.
Mediante el estudio del cariotipo es posible detectar anomalías en el número o en la forma de los cromosomas. La mayoría de estas anomalías provocan deficiencias, y muchos individuos no llegan a nacer o mueren en los primeros meses de vida. La determinación del cariotipo del feto permite detectar, antes del nacimiento, algunas de estas deficiencias.
En algunas especies los pares cromosómicos no pueden diferenciarse claramente considerando sólo sus componentes distintivos en sentido longitudinal; en estos casos se debe recurrir a técnicas citológicas especiales para la tinción de los cromosomas, que evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) a lo largo de los mismos, y que corresponden a los distintos tipos de cromatina. En una especie dada, estas variantes de la cromatina presentan un tamaño y disposición constante. Las técnicas de bandeo cromosómico más usadas son:
·Bandeo C: es relativamente sencilla, y se basa en el uso del colorante Giemsa que tiñe regiones con heterocromatina constitutiva, que en vegetales se halla localizada principalmente en regiones teloméricas, mientras que en animales, se encuentra en regiones centroméricas.
·Bandeos G, R, Q: son técnicas basadas en tratamientos enzimáticos que ponen de manifiesto distintos patrones de bandas de la eucromatina a lo largo del cromosoma. El material se tiñe con colorante Giemsa (G, R) ó colorantes fluorescentes, como laquinacrina (Q). Son las bandas más estudiadas en animales y en el hombre. En los vegetales son muy difíciles de obtener por el alto grado de empaquetamiento de los cromosomas metafásicos.
·Bandeo NOR: permite identificar cromatina con secuencias medianamente repetidas de ADNr, asociada a las regiones NOR del cromosoma. El número total y localización de las regiones NOR es variable, por lo cual, como ya se expresó, además de su importancia funcional tiene valor cariotípico.
La cromatina X se define como un pequeño cuerpo intranuclear, de forma plano convexa y de 0.7 a 1.2 de diámetro. El corpúsculo de Barr puede ser único o múltiple y en éste último caso se debe al exceso de cromosomas X en un individuo. Cada cromatina X corresponde a un cromosoma X heteropicnótico y que replica su DNA más tardíamente que el resto de los cromosomas. En ocasiones se observan cuerpos de Barr de tamaño o forma anormal y esto se debe a anomalías estructurales de uno de los cromosomas X. El cuerpo de Barr puede estudiarse en tres tipos de células: Células nerviosas, Células epiteliales y Leucocitos polimorfonucleares; y la manera de estudiarse es en el epitelio de la mucosa bucal es el tejido más adecuado para la demostración de la cromatina sexual.
Los cuerpos cromatínicos sexuales no solo distinguen a las células femeninas normales de las masculinas, si no que también son útiles para diagnosticar varios tipos de anomalías en los cromosomas sexuales de los seres humanos. En ciertos cromosomas se relacionan directamente con el número de cuerpos cromáticos sexuales; quienes poseen dos o más cromosomas X presentan un cuerpo cromatínico menos que el número de cromosomas X presentes.
Referencias
· Lodish, H. et. al. Biología celular y molecular.5° ed. Edit. Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2008. pp. 234-243.
· McKee, T. Bioquímica. 3° ed. Edit. McGraw-Hill. Edit. Interamericana.
· Novo Villaverde FJ. Genética Humana.Conceptos, mecanismos y aplicaciones de lagenética en el campo de la biomedicina.Editorial Pearson. Madrid, España. 2007.
· Lynch MJ. Et al. Métodos de Laboratorio. 2daedición. Vol.2. Editorial Interamericana.México. 1977.
· http://www.scribd.com/doc/14671166/Cultivo-de-linfocitos-Cromatina-Sexual-y-Cariotipo
