Cultivo de Linfocitos T

SIEMBRA
Medio de cultivo
· RPMI 1640 (8.0 ml)
· Suero Bovino Fetal (SBF) (1.5 ml)
· Glutamina (0.1 ml)
· Penicilina/estreptomicina (0.1 ml)

Homogenizar y agregar:
· Sangre total (0.5 ml)
· Fitohemaglutinina (0.1 ml)

Cultivar a 37ºC en 5% de CO2 y 95% de humedad por 48 a 72 horas, dependiendo de la técnica que se va a realizar.

COSECHA
· Cumplidas las 72 horas agregar Colcemide 0.1 ml (por 20 a 30 min. mezclar bien).
· Pasados los 30 minutos vaciar los cultivos a tubos de centrífuga y centrifugar a 1000 rpm por 8 minutos.
· Aspirar sobrenadante, resuspender el pellet celular en 0.5 ml y agregar KCl 0.075M a 37 ºC hasta completar 10ml. Agitar suavemente.
· Llevar a la estufa a 37ºC por 30 a 40 minutos.
· Mezclar por inversión y agregar 2 ml de fijador Metano/Ácido Acético 3:1 mezclar nuevamente
Centrifugar 8 min. a 100 rpm.
· Aspirar el sobrenadante, dejar 0.5 ml, resuspender el botón celular y agregar gota a gota 2 ml de fijador agitando permanentemente y luego completar 4 ml.
· Volver a lavar las veces que sea necesario con fijador (3-4 veces).
· Si debe detener el proceso, puede hacerlo en el 1er fijador y continuar posteriormente, manteniendo a 4ºC.
· Limpiar potaobjetos en alcohol 96º.
· Gotear la suspensión celular revisando la calidad de las placas en microscopio con contraste de fases.
· Envejecer los preparados 1 noche a 65ºC 3-4 días a 37ºC