Técnica de Cultivo de Linfocitos de Sangre Periférica Para Estudio Cromosómico

1. CULTIVO
• Materiales:
· Frasco de cultivo T25 con tapa rosca
· Medio de cultivo RPMI 1640
· Suero Bovino Fetal (SBF) (inactivado por calor)
· Glutamina (aminoácido)
· Penicilina/estreptomicina (antibióticos y antifúngicos)
· Fitohemaglutinina (PHA) (mitógeno)
· Muestra de sangre periférica total
· Jeringa o vaccutainer para toma de muestra

• Montaje:
En condiciones de completa esterilidad en el frasco de cultivo agregar:
· 8ml de medio
· 1.8ml de SBF
· 0.1 ml Glutamina
· 0.1 ml Penicilina/Estreptomicina

Homogenizar estos reactivos y agregar:
· 0.5 ml de sangre total
· 0,1 ml de fitohemaglutinina
Agitar, tapar, dejando la tapa con ¼ de vuelta suelta.
Llevar a una estufa de cultivo a 37ºC con 5% de CO2 y un 95% de humedad.

2. COSECHA
· Cumplidas 72 horas de cultivo, agregar 100 ul de colcemide durante 20 a 30 min.
· Centrifugar a 1000 rpm durante 8 a 10 min.
· Aspirar el sobrenadante y agregar 10 ml de KCl 0.075M (1.398g/250ml) a 37ºC.
· Mezclar suavemente y llevar a estufa a 37ºC por 30 min.
· Mezclar por inversión y agregar 2ml de fijador Metanol/Ac. Acético 3:1 (Fijador Carnoy)
· Centrifugar durante 8 min a 1000 rpm.
· Aspirar el sobrenadante, dejando 0.5 ml, resuspender las células y agregar 8 ml de fijador gota a gota durante los primeros 2 ml y completar los 8 ml agitando suavemente.
· Repetir las veces que sea necesario hasta obtener una mezcla limpia y transparente.
· Guardar en fijador hasta que se pueda hacer el goteo
· Gotear sobre portas limpios.